Muestreadores Microbiológicos Laboratorista Ambiental

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PRÁCTICA Muestreadores Microbiológicos

INTRODUCCIÓN:
Como parte de la amplia gama de compuestos presentes en el aire (químicos, niebla, partículas de diversos tamaños, etc.) se encuentran el material particulado inorgánico y el orgánico en suspensión este último comprende representantes de grupos biológicos como hongos, esporas, bacterias, virus y sus subproductos metabólicos. Las emisiones al aire conteniendo este tipo de agentes son denominadas bioaerosoles.
Con la excepción de los lugareas diseñados para ser ambientes estériles, los bioaerosoles se encuentran en todos los ambientes pero una alta concentración de los mismos puede determinar la presencia de factores de contaminación biológica elevada (i.e.: desechos cloacales, materia orgánica en estado de descomposición, focos contaminantes en conductos de ventilación, etc.), por lo que un plan de muestreo, así como la cuantificación e identificación de microorganismos son herramientas importantes para prevenir la contaminación o para la aplicación de medidas correctivas adecuadas.
La medición de los agentes biológicos no es un proceso sencillo, la propia naturaleza de los agentes biológicos, son seres vivos, y sus requerimientos vitales, condicionan la medición que deberá ser planificada cuidadosamente. De la cadena de preguntas que deben ser respondidas: por qué hay que medir; qué tipos de agentes biológicos se van a medir; dónde, cuándo y cuántas muestras se deben tomar para obtener resultados representativos y, por último, cómo se van a medir, es, quizá, esta última cuestión una de las que mayor importancia reviste.
Una parte importante de los equipos disponibles para el muestreo de bioaerosoles son derivaciones y modificaciones de los utilizados para la captación de agentes químicos, esas modificaciones consisten, no tanto en los principios de funcionamiento, sino en los soportes de captación que deben adaptarse a las características de los agentes biológicos.
El principal condicionante de los soportes de captación, cuando se trata de captar microorganismos vivos y cultivables, es que el material en el que se recogen las partículas de bioaerosol permita la supervivencia de los mismos hasta que sean analizados en el laboratorio.
Los requisitos que debe reunir un soporte de captación son los siguientes: proporcionar el medio nutritivo y agua apropiados para los organismos en cuestión, estar constituidos de un material que no dañe a las células durante la captación. Estos requisitos los reúnen los medios de cultivo, generalmente, semi-sólidos, elaborados a base de agar (sustancia gelatinosa extraída de algas marinas) y otras substancias a las que se añaden nutrientes y otros productos que definirán las propiedades del medio de cultivo. Los medios de cultivo son la base de los ensayos analíticos utilizados para la identificación de las especies microbianas.
Cuando lo que se trata de captar son formas resistentes (esporas, granos de polen, etc.) o productos (endotoxinas, micotoxinas, glucanos, etc.), el soporte de captación más frecuentemente utilizado es el filtro; en estos casos los agentes captados son materia inerte o están suficientemente preparados para sobrevivir en unas condiciones adversas.

Eficacia del muestreo
La física de la captación de partículas suspendidas en el aire y los principios generales para una buena toma de muestras son aplicables a todo tipo de materia con independencia de si es de origen biológico o no. No obstante, muchos de estos principios básicos requieren de una adaptación cuando el material que se trata de muestrear es un bioaerosol.
Un requisito imprescindible de todos los muestreadores de aerosoles es que deben tener una eficacia del muestreo conocida y documentada, capaz de muestrear, por ejemplo, la totalidad de microorganismos, los microorganismos viables o los componentes microbianos. La eficacia de muestreo está determinada por el diseño de elementos tales como: el dispositivo de entrada de aire al equipo, y la zona de captación, así como, el propio soporte de captación. En la captación de algunos de los componentes del bioaerosol (microorganismos viables y cultivables) estos aspectos adquieren mayor relevancia y se concretan en un aspecto, que es la eficacia de conservación biológica.

Eficacia de la zona de captación (EZC)
Es la medida de la habilidad de un muestreador para separar las partículas del flujo de aire aspirado y depositarlas en el soporte de captación. Un aspecto crítico para la representatividad de la muestra es que se produzca la mínima pérdida de partículas posible, ya sea por que éstas quedan retenidas en las paredes del equipo o por que rebotan sobre los soportes de captación y vuelven al aire. Un buen diseño del equipo puede minimizar estos aspectos, principalmente reduciendo la distancia y el tiempo entre la entrada del aire y el soporte de captación.
Eficacia de conservación biológica (ECB)
Como se deduce de la definición expresada en la introducción del apartado, la eficacia de la conservación biológica es una medida de la capacidad del muestreador de preservar hasta el análisis de las muestras las características esenciales de los agentes biológicos captados, ya sean éstas su viabilidad, actividad biológica o integridad física. Existen factores como son: la radiación, la sequedad, el calor o el frío, los gases tóxicos, o el estrés mecánico durante el muestreo, entre otros, que pueden afectar a la viabilidad de los microorganismos. El grado de afectación depende, en ocasiones, de en que forma está presente el microorganismo, por ejemplo, las esporas bacterianas son más resistentes que las formas vegetativas, esto es lógico si se tiene en cuenta que las esporas son formas de vida preparadas para resistir largos períodos de tiempo condiciones de vida adversa. Los estudios realizados por algunos autores revelan que las diferentes velocidades de aire usadas por diversos muestreadores pueden tener como consecuencia daños estructurales o metabólicos en los microorganismos.
Estos aspectos también tienen importancia aún cuando los ensayos analíticos no están basados en la viabilidad de los microorganismos, ya que las muestras captadas deben retener su actividad biológica y su integridad física durante la captación, transporte y almacenamiento. Por ejemplo, la integridad física es vital en la observación al microscopio, puesto que ésta se realiza reconociendo elementos claves de su morfología.
Con los métodos disponibles en la actualidad no es posible determinar la eficacia de conservación biológica de un muestreador, el principal motivo es que en los ensayos ideados para su estimación, no existe forma de diferenciar entre cuántos microorganismos han muerto durante la generación del aerosol, cuántos durante la fase aerosol y cuántos durante la captación. No obstante, se han llevado a cabo intentos para establecer ese parámetro a través del estudio de la supervivencia de los microorganismos. Existen cuatro tendencias que se exponen a continuación:
1. La supervivencia (S) se expresa como el número de microorganismos viables captados (Nvc) por el muestreador de ensayo.
S = N
2. La supervivencia relativa (Srel) establecida a partir de la comparación entre el número de microorganismos viables captados por el equipo ensayado con el nú mero de microorganismos viables captados por un muestreador de referencia (Nvc-ref).
Srel = Nvc/Nvc-ref
3. La eficacia de supervivencia (Sef) establecida a partir de la comparación entre el número de microorganismos viables (Nvc) captados por el equipo ensayado y el número total de microorganismos captados (Ntot).
Sef = Nvc/Ntot
4. La eficacia de supervivencia relativa (Sef-rel) establecida al comparar las eficacias de supervivencia del muestreador de ensayo y el usado de referencia.
Sef-rel = (Nvc/Ntot)/(Nvc/Ntot)ref
En opinión de los expertos, la mejor forma de expresar la eficacia de conservación biológica es utilizar este último método para determinar la eficacia de supervivencia relativa.

LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS MÁS IMPORTANTES:

- Gravitación o impactación natural: Es la forma más simple de toma de muestra de bioaerosoles, en la cual las partículas biológicas aerotransportadas son recogidas sobre una superficie adherente (agar en una placa Petri o recubriendo un portaobjetos, placas RODAC,...) por su capacidad de sedimentar por gravedad.
Es un procedimiento útil para estudios iniciales y para la estimación aproximada de la carga microbiológica tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo, si se eligen adecuadamente los medios de cultivo.

- Impactación: El aire, aspirado por una bomba de vacío que forma parte del muestreador, pasa a través de un orificio y es dirigido a la superficie del medio de cultivo
contenido en una placa adecuada.
Muchos muestreadores emplean este método, algunos recogen las partículas sobre una superficie única, mientras otros las recogen por diferentes fracciones de tamaño (diámetro aerodinámico equivalente), en superficies sucesivas (impactación en cascada). Ejemplos de estos muestreadores por impactación incluyen los de rendija (Casella), impactadores de etapa simple (SAS), impactadores Andersen de 1, 2 y 6 etapas o placas (este último considerado como método de referencia), impactador en cascada de May que recoge fracciones sobre portaobjetos.

- Centrifugación: Estos muestreadores de impactación utilizan la fuerza centrífuga para ayudar a la separación de las partículas de la corriente de aire de aspiración. Operan creando un remolino en el cual las partículas con suficiente inercia dejan la corriente de aire para impactar sobre la superficie (medio de cultivo) de recogida.

- Burbujeo o impinger: El aire a muestrear pasa a través de un volumen conocido de líquido (suero salino, agua de peptona con agentes humectantes, medios líquidos...). Las partículas abandonan la corriente de aire por impactación en el líquido, quedando retenidas en el mismo. Posteriormente, y en el medio de cultivo adecuado, se transfiere una alícuota del líquido de captación, procediéndose a su cultivo, recuento y en su caso a su identificación (viables o cultivables).

- Filtración: El aire es aspirado a través de un medio de filtración en el cual las partículas se depositan.
El tipo de filtro más utilizado es el de membrana de policarbonato ya que las partículas pueden ser removidas fácilmente de su superficie por agitación en líquidos adecuados, procediéndose a la posterior inoculación de la suspensión formada en los medios de cultivos específicos.

Clasificación de los contaminantes biológicos
Se describen a continuación, de forma sucinta, las características de diferentes agentes biológicos.

Virus
Son las formas de vida más simples, están constituidas únicamente por material genético: ADN (Acido desoxirribonucleico) o ARN (Acido ribonucleico) y una cápside o cubierta proteica.
Son parásitos obligados, es decir, precisan de un huésped para poder reproducirse.
La infección la llevan a cabo inyectando su material genético en las células del huésped. Una vez en su interior se sirven de la maquinaria biológica del huésped para producir copias de sí mismos hasta lograr su total recomposición y en un número tal que rompe las membranas celulares pasando así a infectar nuevas células.

Bacterias
Son organismos más complejos que los virus y a diferencia de ellos son capaces de vivir, en un medio adecuado, sin la necesidad de un huésped para completar su desarrollo. De todos modos un buen número de ellos son patógenos para el hombre.
Es de destacar la capacidad de elaborar esporas que presentan algunas bacterias. Las esporas no son más que formas de vida resistentes a condiciones adversas. Pueden resistir, durante años incluso, altas temperaturas, sequedad, falta de nutrientes, etc.... , recuperando su estado normal y capacidad infectiva al entrar en contacto con un medio adecuado para su desarrollo.

Hongos
Son formas complejas de vida que presentan una estructura vegetativa denominada micelio que está formada por hifas (estructuras filiformes por las que circula el citoplasma plurinucleado). Esta estructura vegetativa surge de la germinación de sus células reproductoras o esporas. Su hábitat natural es el suelo, pero algunos componentes de este grupo son parásitos tanto de hombres y animales como de vegetales.

TERMINOLOGÍA
Agar: El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 ºC. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
Aire Limpio: es aquél libre de partículas sucias y de microorganismos. Existe una serie de tratamientos para obtener aire libre de contaminantes. El aire de entrada atraviesa un prefiltro (retiene partículas grandes); luego pasa por un precipitador electrostático (atracción de partículas cargadas eléctricamente); luego atraviesa un filtro HEPA (retiene microorganismos y partículas en suspensión en el aire de tamaño superior a 0,3 micrones). El otro tratamiento es el sistema Kathabar (combustión de superficie) el cual limpia el aire de entrada por lavado con una solución aséptica y además controla la humedad. El aire limpio y aséptico se introduce al área aséptica y se mantiene bajo presión positiva.
Área Biolimpia: Se llama área de contaminación controlada o área biolimpia o zona limpia a aquella área o espacio delimitado en el cual la contaminación ambiental, en términos de partículas y de microorganismos, así como la carga microbiana en las superficies (murallas, cielos, pisos, equipos) y la carga microbiana sobre el personal (máscaras, gorros, delantales, cubre calzados, guantes) se encuentran dentro de los límites especificados para ella.
Colonia: Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia.
Corte de partículas (d50): es el diámetro de las partículas, donde el 50% de las partículas llegan al agar (es decir pueden formar una colonia). Está determinado por la velocidad de retención y el tamaño y forma del orificio.
Estufa de Incubación: Es un equipo utilizado en los laboratorios, para incubar los medios de cultivo en un ambiente de temperatura controlados. Utiliza una resistencia eléctrica que genera calor al interior de una cámara a manera de un horno. La temperatura generada es controlada por un termostato. La temperatura a la que se realice este proceso condiciona críticamente la calidad del medio. Estufa con aire forzado con doble puerta, una de vidrio interna y otra externa, con termostato preciso y un sistema de circulación interna del calor, son una buena alternativa.
El equipo debe tener:
-Selector de temperatura. Un termostato que mantenga la temperatura en el rango de 0-100 °C, con una precisión de ± 1 °C o mayor.
-Termómetro preciso, preferentemente con indicador externo que permita controlar la temperatura interior del equipo sin abrirlo.
Filtros de Alta Eficiencia: Estos filtros denominados HEPA y ULPA por sus iniciales en inglés (High Efficiency Particulate Air y Ultra Low Penetration Air), son los filtros mas eficientes conocidos por el hombre, retienen el 99.97 y el 99.999% respectivamente, de partículas tan pequeñas como 0.3 micrones y fueron desarrollados por la Comisión Atómica de los EE.UU. durante la segunda guerra mundial, para remover el polvo radioactivo de los ductos de ventilación de las plantas atómicas. Estos filtros se componen de fibras, compuestas por fibra de vidrio y con diámetros entre 0.2 y 0.5 micrones, entrelazadas de forma aleatoria y espaciadas entre sí más de 0.3 µm.
Los filtros HEPA y ULPA evitan la propagación de bacterias y virus a través del aire y, por tanto, son muy importantes para prevenir infecciones.

Medios de Cultivos: El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuada, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 32,5 ± 2,5ºC para el caso de aerobios y 22,5 ± 2,5ºC para hongos y levaduras, con tiempos de incubación de 48 y 72 horas respectivamente, proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

Unidad Formadora de Colonia (UFC): Se denomina a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo.
En el caso de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias aisladas sino formaciones más difusas o miceliares.

Velocidad de retención: Es la velocidad de la partícula cuando llega al agar. Viene determinada por la velocidad del flujo, el número de orificios y el diámetro del orificio.

RESULTADO DE APRENDIZAJE:

El estudiante conoce diferentes tipos de muestreadores biológicos, sus partes, instrumentos asociados, aprende para qué sirven.
El estudiante instala muestreadores biológicos, registra y conserva muestras para su transporte y posterior análisis.
Aumento su léxico.

Se evaluará con la actividad con muestreadores microbiológicos que se realizó en la Salida de prácticas a Puertecitos, Baja California.

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